IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid), yüksek oranda indüklenebilir olan bir β-galaktosidaz substrat analoğudur.IPTG'nin indüksiyonu altında, indükleyici, baskılayıcı protein ile bir kompleks oluşturabilir, böylece baskılayıcı proteinin yapısı değiştirilir, böylece hedef gen ile birleştirilemez ve hedef gen verimli bir şekilde ifade edilir.Peki deney sırasında IPTG konsantrasyonu nasıl belirlenmelidir?Ne kadar büyük o kadar iyi?
İlk olarak, IPTG indüksiyon ilkesini anlayalım: E. coli'nin laktoz operonu (elementi), sırasıyla β-galaktosidaz, permeaz ve asetiltransferazı kodlayan Z, Y ve A olmak üzere üç yapısal gen içerir.lacZ, laktozu glikoz ve galaktoza veya allo-laktoza hidrolize eder;lacY ortamdaki laktozun hücre zarından geçmesini ve hücre içine girmesini sağlar;lacA, asetil grubunu asetil-CoA'dan β-galaktozide aktarır, bu Toksik etkinin giderilmesini içerir.Ek olarak, bir işletim dizisi O, bir başlangıç dizisi P ve bir düzenleyici gen I vardır. I gen kodu, operatör dizisinin O konumuna bağlanabilen bir baskılayıcı proteindir, böylece operon (meta) bastırılır ve kapalı.Başlatıcı sekans P'nin üst kısmında katabolik gen etkinleştirici protein-CAP bağlanma bölgesi için bir bağlanma sahası da vardır. P sekansı, O sekansı ve CAP bağlanma sahası birlikte lac operonunun düzenleyici bölgesini oluşturur.Üç enzimin kodlayıcı genleri, gen ürünlerinin koordineli ifadesini elde etmek için aynı düzenleyici bölge tarafından düzenlenir.
Laktoz yokluğunda, lak operonu (meta) bir baskı durumundadır.Bu sırada, PI promotör dizisinin kontrolü altında I dizisi tarafından eksprese edilen lac baskılayıcı, O dizisine bağlanır, bu da RNA polimerazın P dizisine bağlanmasını önler ve transkripsiyon başlangıcını engeller;laktoz mevcut olduğunda lak operon (meta) indüklenebilir. Bu operon (meta) sistemde gerçek indükleyici laktozun kendisi değildir.Laktoz hücreye girer ve allolaktoza dönüştürülmek üzere β-galaktosidaz tarafından katalize edilir.İkincisi, bir indükleyici molekül olarak, baskılayıcı proteine bağlanır ve baskılayıcı proteinin O dizisinden ve transkripsiyondan ayrışmasına yol açan protein konformasyonunu değiştirir.İzopropiltiogalaktozid (IPTG), allolaktoz ile aynı etkiye sahiptir.Bakteriler tarafından metabolize edilmeyen ve çok kararlı olan çok güçlü bir indükleyicidir, bu nedenle laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
IPTG'nin optimum konsantrasyonu nasıl belirlenir?Örnek olarak E. coli'yi ele alalım.
Pozitif rekombinant pGEX (CGRP/msCT) içeren E. coli BL21 genetik mühendisliği ürünü suşu, 50μg·mL-1 Amp içeren LB sıvı ortamına aşılandı ve gece boyunca 37°C'de kültürlendi.Yukarıdaki kültür, genleşme kültürü için 1:100 oranında 50μg·mL-1 Amp içeren 10 şişe 50mL taze LB sıvı ortama aşılandı ve OD600 değeri 0.6~0.8 olduğunda, nihai konsantrasyona IPTG eklendi.0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1'dir.Aynı sıcaklıkta ve aynı zamanda indüksiyondan sonra, içinden 1 mL bakteri solüsyonu alındı ve bakteri hücreleri santrifüjleme ile toplandı ve farklı IPTG konsantrasyonlarının protein ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için SDS-PAGE'ye tabi tutuldu ve ardından en büyük protein ifadesine sahip IPTG konsantrasyonunu seçin.
Deneylerden sonra, IPTG konsantrasyonunun mümkün olduğu kadar büyük olmadığı görülecektir.Bunun nedeni, IPTG'nin bakterilere karşı belirli bir toksisiteye sahip olmasıdır.Konsantrasyonun aşılması hücreyi de öldürür;ve genel olarak konuşursak, hücrede ne kadar çok çözünür protein ifade edilirse o kadar iyi olacağını umuyoruz, ancak birçok durumda IPTG konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, büyük miktarda inklüzyon oluşacaktır.Vücutta ancak çözünür protein miktarı azaldı.Bu nedenle, en uygun IPTG konsantrasyonu genellikle ne kadar büyükse o kadar iyidir değil, konsantrasyon ne kadar düşükse o kadar iyidir.
Genetiği değiştirilmiş suşların uyarılması ve yetiştirilmesinin amacı, hedef proteinin verimini artırmak ve maliyetleri azaltmaktır.Hedef genin ekspresyonu sadece suşun kendi faktörlerinden ve ekspresyon plazmidinden etkilenmez, aynı zamanda indükleyicinin konsantrasyonu, indüksiyon sıcaklığı ve indüksiyon süresi gibi diğer dış koşullardan da etkilenir.Bu nedenle, genel olarak, bilinmeyen bir protein ifade edilmeden ve saflaştırılmadan önce, uygun koşulları seçmek ve en iyi deneysel sonuçları elde etmek için indüksiyon süresini, sıcaklığı ve IPTG konsantrasyonunu incelemek en iyisidir.
Gönderim zamanı: 31 Aralık 2021